stable Electroporation-Competent Cell 克隆 (電擊) 感受態細胞

基因型：

F'proA+B+ lacIq ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ?(ara-leu)7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rphspoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC)

簡要說明：

Stable 電擊感受態細胞只能用于電擊轉化，不可用于熱激轉化。

Stable 菌株是NEB 公司開發的高轉化效率菌株，是逆轉錄病毒/慢病毒載體系統推薦使用的菌株，具有與Stbl2， Stbl3  wan全不同的基因型，但是表現出比Stbl2，Stbl3 更優異的性能，特別適合慢病毒或具有末端重復序列DNA 片段的克隆。基因組含有重組酶recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率；同時含有核酸酶 endA1突變，避免了提取質粒過程中核酸酶的污染，大大提高了高純度病毒質粒的產量和質量。lacZΔM15 的存在使Stable 可用于藍、白斑篩選，此菌株具有四環素和lian霉素抗性.

Stable電擊感受態細胞適用于大質粒的構建或者各種具有末端重復序列的復雜 DNA文庫構建，經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率>2×1010 cfu/μg DN

操作說明：

一、0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5分鐘，待其瀝干水分，正置 5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置 5分鐘充分降溫。

二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質粒或連接產物)并用手bo打EP 管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。A. 測定轉化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質粒 pUC19；  B. 對于連接產物，請用乙醇沉淀DNA 后加入適量 TE緩沖液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重懸，DNA 濃度不超過100ng/μl，體積不超過 5μl/50μl 感受態。

三、用200 μl槍頭將感受態-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。

四、啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8kV(此為 BioRad 電轉儀推薦參數，也可按所用電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。

五、2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 700 μl不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后，轉移到 50ml 離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養基至 5ml。37℃，225rpm 復蘇60 分鐘。

六、5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C 平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑 15cm培養皿2-5 個）。將平板倒置放于 37℃培養箱過夜培養13-17 小時。

注意事項：

（一）加入DNA 時體積不應大于感受態體積的1/10。

（二）電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

（三）當DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。

（四）電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA 的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

（五）若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

（六）對于連接產物轉化， 最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重懸產物，保證DNA 濃度不超過 100ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

（七）混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態細胞時不可用孔徑過小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應剪去槍頭尖0.6cm)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質粒或連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。

（八）電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。